miércoles, 30 de octubre de 2013

Caracterización de la vía de señalización involucrada en los efectos de alta D-glucosa sobre la expresión de subunidades del complejo NADPH oxidasa en endotelio fetal humano

Resumen

La hiperglicemia está asociada a problemas cardiovasculares por un mecanismo que involucra disfunción endotelial, la cual es causada por una disminución de la biodisponibilidad de NO generada por un incremento de las especies reactivas del oxígeno (ROS) inducido por alta concentración extracelular de D-glucosa. Proteína quinasa C (PKC) y p38MAPK podrían estar involucradas como moduladores de la síntesis de superóxido (O2•-) por NADPH oxidasa (NOX), la principal fuente de O2•- en endotelio humano. Nuestro objetivo fue determinar si la vía de señalización inducida por alta D-glucosa extracelular involucra la modulación de la expresión de NOX y si esta es dependiente de la actividad de PKC y/o p38MAPK.
Las células endoteliales fueron aisladas de la vena del cordón umbilical (HUVEC) de placentas obtenidas de embarazos normales (aprobado por el comité ético del Hospital Guillermo Grant Benavente y con consentimiento informado de las pacientes). La células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) fueron aisladas por digestión con colagenasa (a 37°C) y cultivadas en medio 199 (M199) suplementado con 20% de suero de bovino fetal y de recién nacido. HUVEC fueron incubadas (24h) con M199 conteniendo 5mM (control) o 25 mM de D-glucosa (alta D-glucosa) en ausencia o presencia de calfostina C (CC, inhibidor de PKC), PD169316 (inhibidor de p38MAPK) y/o apocinina (inhibidor de NOX). Los niveles de mRNA fueron determinados por RT-PCR desde RNA total usando los partidores para NOX2, NOX4, p47phox, mieloperoxidasa (MPO) y 28S; la abundancia de la proteína p67phoxfue determinada por western blot y los niveles de ROS por fluorescencia derivada de la oxidación de diclorofluoresceína (DCF).
Alta D-glucosa incrementó  el mRNA de p47phox, NOX2 y NOX4 en HUVEC (ANOVA prueba tstudent no pareada, p<0.05). Los aumentos de los niveles de mRNA fueron bloqueados por la coincubación con CC, PD169316 y apocinina. La coincubación de CC y PD169316 no muestra una respuesta aditiva en presencia de alta D-glucosa. Además, MPO fue detectada en HUVEC, la cual es una proteína clave en el mecanismo de inhibición de apocinina. Así como en el caso de los niveles de mRNA, alta D-glucosa indujo un aumento de la abundancia de p67phox e incrementó la síntesis de ROS, efectos bloqueados por la coincubación con CC, PD169316 y apocinina.

En conclusión, alta D-glucosa incrementa la expresión y actividad del complejo de NADPH oxidasa a través de un mecanismo mediado por la actividad de PKC, p38MAPK y la propia NOX2 en endotelio fetal humano. Además, alta D-glucosa incrementa la expresión del mRNA de MPO, respaldando el uso de apocinina como inhibidor de NOX en HUVEC y, aún más importante, mostrando un potencial rol de MPO en la respuesta celular al estrés inducido por alta D-glucosa.

Abstract
The hyperglycemia is associated with cardiovascular problems in a mechanism that involves endothelial dysfunction, which is caused by a decrease of NO’s bioavailability generated by an increase of reactive oxygen species (ROS) induced by high extracellular concentration of D-glucose. Protein kinase C (PKC) and p38MAPK could be involved as modulators of the synthesis of superoxide by NADPH oxidase (NOX), the main source of superoxide in human endothelium. Our aim was to determine if the signaling pathway induced by high extracellular D-glucose involves the modulation of expression of NOX and if it is dependent of activity of PKC and/or p38MAPK.
Biological samples were obtained from normal pregnancies (Guillermo Grant Benavente Hospital ethics committee approval and informed patients consent were obtained). Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated by collagenase digestion (37°C) and cultured medium 199 (M199) supplemented with 20% newborn and fetal calf sera. HUVEC were incubated (24 h) with M199 containing 5 mM (control) or 25 mM of D-glucose (high D-glucose) in absence or presence of calphostin C (CC,PKC inhibitor), PD169316 (p38MAPK inhibitor) and/or apocynin (NOX inhibitor). mRNA levels were determined by RT-PCR from total RNA using primers for NOX2, NOX4, p47phox, myeloperoxidase (MPO) and 28S; the abundance of protein p67phox by western blot andthe ROS levels by fluorescence derivated from oxidation of dichlorofluorescein (DCF).
High D-glucose increased (ANOVA unpaired Student’s test, p<0.05) the mRNA of p47phox, NOX2 and NOX4. Increases of NOX2 and NOX4 levels were blocked by co-incubation with CC, PD169316 and apocynin. Co-incubation of CC and PD169316 do not show an additive response in presence of high D-glucose. Moreover, MPO was detected in HUVEC,wich is a key protein in the inhibition mechanism of apocynin. As well as the mRNAs, high D-glucose induced an increase of abundance of p67phox and increased the synthesis of ROS, effects blocked by co –incubation with CC, PD169316 and apocynin.
In conclusion, high D-glucose increases the expression and activity of the NAPH oxidase complex through a mechanism mediated by the activity of PKC, p38MAPK and NOX2 on human fetal endothelium. Also, high D-glucose increases the MPO expression, validating the use of apocynin like NOX inhibitor in HUVEC and, most importantly, showing a potential role of MPO in cellular responses to stress induced by high D-glucose.



Tesis realizada por Roberto Villalobos para obtener título de Bioquímico, Universidad de Concepción, 2012.