Resumen
La
hiperglicemia está asociada a problemas cardiovasculares por un mecanismo que
involucra disfunción endotelial, la cual es causada por una disminución de la
biodisponibilidad de NO generada por un incremento de las especies reactivas
del oxígeno (ROS) inducido por alta concentración extracelular de D-glucosa. Proteína
quinasa C (PKC) y p38MAPK podrían estar involucradas como
moduladores de la síntesis de superóxido (O2•-) por NADPH
oxidasa (NOX), la principal fuente de O2•- en endotelio humano. Nuestro
objetivo fue determinar si la vía de señalización inducida por alta D-glucosa
extracelular involucra la modulación de la expresión de NOX y si esta es
dependiente de la actividad de PKC y/o p38MAPK.
Las células
endoteliales fueron aisladas de la vena del cordón umbilical (HUVEC) de
placentas obtenidas de embarazos normales (aprobado por el comité ético del
Hospital Guillermo Grant Benavente y con
consentimiento informado de las pacientes). La células endoteliales de vena umbilical
humana (HUVEC) fueron aisladas por digestión con colagenasa (a 37°C) y cultivadas
en medio 199 (M199) suplementado con 20% de suero de bovino fetal y de recién
nacido. HUVEC fueron incubadas (24h) con M199 conteniendo 5mM (control) o 25 mM
de D-glucosa (alta D-glucosa) en ausencia o presencia de calfostina C (CC,
inhibidor de PKC), PD169316 (inhibidor de p38MAPK) y/o apocinina
(inhibidor de NOX). Los niveles de mRNA fueron determinados por RT-PCR desde
RNA total usando los partidores para NOX2, NOX4, p47phox,
mieloperoxidasa (MPO) y 28S; la abundancia de la proteína p67phoxfue
determinada por western blot y los niveles de ROS por fluorescencia derivada de
la oxidación de diclorofluoresceína (DCF).
Alta
D-glucosa incrementó el mRNA de p47phox,
NOX2 y NOX4 en HUVEC (ANOVA prueba tstudent
no pareada, p<0.05). Los aumentos de los niveles de mRNA fueron bloqueados
por la coincubación con CC, PD169316 y apocinina. La coincubación de CC y
PD169316 no muestra una respuesta aditiva en presencia de alta D-glucosa.
Además, MPO fue detectada en HUVEC, la cual es una proteína clave en el mecanismo
de inhibición de apocinina. Así como en el caso de los niveles de mRNA, alta
D-glucosa indujo un aumento de la abundancia de p67phox e incrementó
la síntesis de ROS, efectos bloqueados por la coincubación con CC, PD169316 y
apocinina.
En conclusión,
alta D-glucosa incrementa la expresión y actividad del complejo de NADPH
oxidasa a través de un mecanismo mediado por la actividad de PKC, p38MAPK y
la propia NOX2 en endotelio fetal humano. Además,
alta D-glucosa incrementa la expresión del mRNA de MPO, respaldando el uso de
apocinina como inhibidor de NOX en HUVEC y, aún más importante, mostrando un
potencial rol de MPO en la respuesta celular al estrés inducido por alta
D-glucosa.
Abstract
The hyperglycemia is associated with cardiovascular problems in a
mechanism that involves endothelial dysfunction, which is caused by a decrease
of NO’s bioavailability generated by an increase of reactive oxygen species
(ROS) induced by high extracellular concentration of D-glucose. Protein kinase
C (PKC) and p38MAPK could be involved as modulators of the synthesis
of superoxide by NADPH oxidase (NOX), the main source of superoxide in human
endothelium. Our aim was to determine if the signaling pathway induced by high extracellular
D-glucose involves the modulation of expression of NOX and if it is dependent
of activity of PKC and/or p38MAPK.
Biological samples were obtained from normal pregnancies
(Guillermo Grant Benavente Hospital ethics
committee approval and informed patients consent
were obtained). Human
umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated by collagenase digestion
(37°C) and cultured medium 199 (M199) supplemented with 20% newborn and fetal
calf sera. HUVEC were incubated (24 h) with M199 containing 5 mM (control) or
25 mM of D-glucose (high D-glucose) in absence or presence of calphostin C (CC,PKC
inhibitor), PD169316 (p38MAPK inhibitor) and/or apocynin (NOX
inhibitor). mRNA levels were determined by RT-PCR from total RNA using primers
for NOX2, NOX4, p47phox, myeloperoxidase (MPO) and 28S; the
abundance of protein p67phox by western blot andthe ROS levels by
fluorescence derivated from oxidation of dichlorofluorescein (DCF).
High D-glucose increased (ANOVA unpaired Student’s
test, p<0.05) the mRNA of p47phox, NOX2 and NOX4. Increases of
NOX2 and NOX4 levels were blocked by co-incubation with CC, PD169316 and
apocynin. Co-incubation of CC and PD169316 do not show an additive response in
presence of high D-glucose. Moreover, MPO was detected in HUVEC,wich is a key
protein in the inhibition mechanism of apocynin. As well as the mRNAs, high
D-glucose induced an increase of abundance of p67phox and increased the
synthesis of ROS, effects blocked by co –incubation with CC, PD169316 and
apocynin.
In conclusion, high D-glucose increases the expression
and activity of the NAPH oxidase complex through a mechanism mediated by the
activity of PKC, p38MAPK and NOX2 on human fetal endothelium. Also,
high D-glucose increases the MPO expression, validating the use of apocynin
like NOX inhibitor in HUVEC and, most importantly, showing a potential role of
MPO in cellular responses to stress induced by high D-glucose.
Tesis realizada por Roberto Villalobos para obtener título de Bioquímico, Universidad de Concepción, 2012.
