Resumen
El tono vascular es controlado por la ruta L-arginina/óxido nítrico (NO), y la biodisponibilidad de NO es fuertemente afectada por el estrés oxidativo inducido por la hiperglicemia. La insulina aumenta la expresión y actividad de los transportadores de aminoácidos catiónicos de tipo 1 (hCAT-1), la síntesis de NO y la vasodilatación; por lo tanto, es probable que exista un rol protector de insulina sobre las alteraciones de la función vascular inducidas por alta D-glucosa. La reactividad vascular a U46619 (mimético de tromboxano A2) y al péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP) fue determinada en anillos de vena umbilical (miografía de alambre) incubados en D-glucosa normal (5 mM) o alta (25 mM). La expresión y actividad de hCAT-1, NO sintasa endotelial (eNOS), proteínas quinasas activadas por mitógenos de 42 y 44 kDa (p42/44mapk), proteína quinasa B (PKB) fue determinada mediante western blot y qRT-PCR. Los niveles de tetrahidrobiopterina (BH4) fueron determinados por HPLC y el transporte de L-arginina (0-1000 uM) fue medido en respuesta a 5-25 mM de D-glucosa (0-36 horas) en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Los ensayos se realizaron en ausencia o presencia de insulina y/o apocinina (inhibidor de NADPH oxidasa), tempol o Mn(III)TMPyP (mimético de SOD). Alta D-glucosa aumenta la expresión y actividad de hCAT-1 de una manera bifásica (peaks: 6 y 24 horas de incubación). El aumento de la velocidad de transporte inducido por alta D-glucosa fue bloqueado por insulina y se correlaciona con menor expresión de hCAT-1 y actividad del promotor del gen SLC7A1. El aumento del transporte inducido por alta D-glucosa es paralelo al aumento de especies reactivas derivadas del oxígeno (ROS) y anión superóxido (O2•–), junto con mayor contracción inducida por U46619 y menor relajación inducida por CGRP. La insulina y apocinina atenúan la generación de ROS y O2•–, y restauran la reactividad vascular. Insulina, pero no apocinina o tempol, revierte la síntesis de No inducida por alta D-glucosa; sin embargo, tempol y Mn(III)TMPyP revierten la reducción de BH4 inducida por alta D-glucosa. Insulina y tempol bloquean la fosforilación de p42/44mapk aumentada por D-glucosa. La disfunción vascular inducida por D-glucosa es atenuada por insulina a través de la regulación de las rutas L-arginina/NO y O2•–/NADPH oxidasa. Estos hallazgos son de interés para una mejor comprensión de la disfunción vascular en estados de resistencia a la insulina e hiperglicemia fetal.
Abstract
Vascular tone is controlled by the L-arginine/nitric oxide (NO) pathway, and NO bioavailability is strongly affected by hyperglycaemia-induced oxidative stress. Insulin leads to high expression and activity of human cationic amino acid transporter 1 (hCAT-1), NO synthesis and vasodilation; thus, a protective role of insulin on high D-glucose–alterations in endothelial function is likely. Vascular reactivity to U46619 (thromboxane A2 mimetic) and calcitonin gene related peptide (CGRP) was measured in KCl preconstricted human umbilical vein rings (wire myography) incubated in normal (5 mmol/L) or high (25 mmol/L) D-glucose. hCAT-1, endothelial NO synthase (eNOS), 42 and 44 kDa mitogen-activated protein kinases (p42/44mapk), protein kinase B/Akt (Akt) expression and activity were determined by western blotting and qRT-PCR, tetrahydrobiopterin (BH4) level was determined by HPLC, and L-arginine transport (0–1000 μmol/L) was measured in response to 5–25 mmol/L D-glucose (0–36 hours) in passage 2 human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Assays were in the absence or presence of insulin and/or apocynin (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase [NADPH oxidase] inhibitor), tempol or Mn(III)TMPyP (SOD mimetics). High D-glucose increased hCAT-1 expression and activity, which was biphasic (peaks: 6 and 24 hours of incubation). High D-glucose–increased maximal transport velocity was blocked by insulin and correlated with lower hCAT-1 expression and SLC7A1 gene promoter activity. High D-glucose–increased transport parallels higher reactive oxygen species (ROS) and superoxide anion (O2•–) generation, and increased U46619-contraction and reduced CGRP-dilation of vein rings. Insulin and apocynin attenuate ROS and O2•– generation, and restored vascular reactivity to U46619 and CGRP. Insulin, but not apocynin or tempol reversed high D-glucose–increased NO synthesis; however, tempol and Mn(III)TMPyP reversed the high D-glucose–reduced BH4 level. Insulin and tempol blocked the high D-glucose–increased p42/44mapk phosphorylation. Vascular dysfunction caused by high D-glucose is likely attenuated by insulin through the L-arginine/NO and O2•–/NADPH oxidase pathways. These findings are of interest for better understanding vascular dysfunction in states of foetal insulin resistance and hyperglycaemia.
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0122398
