EFECTO DEL ESTRÉS OXIDATIVO SOBRE LA EXPRESIÓN Y ACTIVIDAD DE TRANSPORTADORES DE L-ARGININA EN ENDOTELIO FETAL HUMANO

RESUMEN

El estrés oxidativo juega un papel clave en la fisiopatología de las enfermedades vasculares tales como hipertensión, aterosclerosis, diabetes mellitus y cardiomiopatías. Esto ocurre cuando aumentan los niveles intracelulares deespecies reactivas derivadas del oxígeno (ROS), disminuyendo la biodisponibilidad del óxido nítrico (NO), un vasodilatador sintetizado a partir de L-arginina. Este aminoácido se incorpora en las células endoteliales a través de transportadores de aminoácidos catiónicos (hCAT-1 y hCAT-2B). Los efectos de ROS sobre la actividad y/o expresión de hCATs aun no han sido caracterizados en detalle. Nuestro objetivo fue determinar el efecto de la incubación crónica con peróxido de hidrógeno (H₂O₂) en la expresión de hCATs y transporte de L-arginina en endotelio humano.

Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se cultivaron hasta pasaje 2 y fueron tratadas (24h) con H₂O₂ (10^-12-10^-3 M). Los niveles de mRNA de hCAT-1, hCAT2B y 28S fueron determinados por RT-PCR. La abundancia de proteínas de hCAT-1 se determinó por western blot. La captación de L-arginina (100µM) y la cinética de transporte de L-arginina (31,25-1000 µM) se determinó usando L-[³H] arginina en mezcla con L-arginina “fría”. 

Los resultados mostraron que el H₂O₂ aumentó (p<0,05) los niveles de mRNA de hCAT-1 y hCAT-2B. Por otra parte, H₂O₂ disminuyó (p<0,05) la abundancia de proteína hCAT-1 y la captación de L-arginina. Al realizar ensayos de transporte de L-arginina utilizando un amplio rango de concentraciones de este aminoácido fue posible determinar que H₂O₂ disminuye la V_max, mientras que la K_m aparente de transporte se mantuvo sin cambios significativos. 

ABSTRACT

            Oxidative stress plays a key role in vascular diseases such as hypertension, atherosclerosis, diabetes mellitus and cardiomyopathy. This occurs when intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) increase, decreasing the bioavailability of nitric oxide (NO), a vasodilator synthesized from L-arginine. This amino acid is incorporated into endothelial cells by cationic amino acid transporters (hCAT-1 and hCAT-2B). The effects of ROS on activity and/or expression of hCATs are not fully understood. Our aim was determine the effects of chronic incubation with hydrogen peroxide (H₂O₂) on hCATs expression and L-arginine transport in human endothelium.

            Endothelial cells from human umbilical vein (HUVEC) were cultured to passage 2 and treated (24 h) with H₂O₂ (10^-12-10^-3 M).The mRNA levels of hCAT-1, hCAT-2B and 28S were determined by RT-PCR.The protein abundance of hCAT-1 was determined by western blot. L-Arginine uptake (100 µM) and kinetic parameters of L-arginine transport (31,25-1000 µM) was determined using L-[³H]arginine mixed with “cold” L-arginine.

            Results showed that H₂O₂increased (p<0.05) the mRNA levels of hCAT-1 and hCAT-2B. In the other hand,H₂O₂ decreased (p<0.05) the abundance of hCAT-1 protein and L-arginine uptake. When testing L-arginine transport using a wide range of concentrations of this amino acid was possible to determine that H₂O₂ decreases V_max, whereas the apparent K_m of L-arginine transport was maintained without significant changes.

Resumen de Tesis para obtener el título de Bioingeniera de Pamela Careaga, Universidad de Concepción, 2012.

Caracterización de la vía de señalización involucrada en los efectos de alta D-glucosa sobre la expresión de subunidades del complejo NADPH oxidasa en endotelio fetal humano

Resumen

La hiperglicemia está asociada a problemas cardiovasculares por un mecanismo que involucra disfunción endotelial, la cual es causada por una disminución de la biodisponibilidad de NO generada por un incremento de las especies reactivas del oxígeno (ROS) inducido por alta concentración extracelular de D-glucosa. Proteína quinasa C (PKC) y p38^MAPK podrían estar involucradas como moduladores de la síntesis de superóxido (O₂^•-) por NADPH oxidasa (NOX), la principal fuente de O₂^•- en endotelio humano. Nuestro objetivo fue determinar si la vía de señalización inducida por alta D-glucosa extracelular involucra la modulación de la expresión de NOX y si esta es dependiente de la actividad de PKC y/o p38^MAPK.

Las células endoteliales fueron aisladas de la vena del cordón umbilical (HUVEC) de placentas obtenidas de embarazos normales (aprobado por el comité ético del Hospital Guillermo Grant Benavente y con consentimiento informado de las pacientes). La células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) fueron aisladas por digestión con colagenasa (a 37°C) y cultivadas en medio 199 (M199) suplementado con 20% de suero de bovino fetal y de recién nacido. HUVEC fueron incubadas (24h) con M199 conteniendo 5mM (control) o 25 mM de D-glucosa (alta D-glucosa) en ausencia o presencia de calfostina C (CC, inhibidor de PKC), PD169316 (inhibidor de p38^MAPK) y/o apocinina (inhibidor de NOX). Los niveles de mRNA fueron determinados por RT-PCR desde RNA total usando los partidores para NOX2, NOX4, p47^phox, mieloperoxidasa (MPO) y 28S; la abundancia de la proteína p67^phoxfue determinada por western blot y los niveles de ROS por fluorescencia derivada de la oxidación de diclorofluoresceína (DCF).

Alta D-glucosa incrementó  el mRNA de p47^phox, NOX2 y NOX4 en HUVEC (ANOVA prueba tstudent no pareada, p<0.05). Los aumentos de los niveles de mRNA fueron bloqueados por la coincubación con CC, PD169316 y apocinina. La coincubación de CC y PD169316 no muestra una respuesta aditiva en presencia de alta D-glucosa. Además, MPO fue detectada en HUVEC, la cual es una proteína clave en el mecanismo de inhibición de apocinina. Así como en el caso de los niveles de mRNA, alta D-glucosa indujo un aumento de la abundancia de p67^phox e incrementó la síntesis de ROS, efectos bloqueados por la coincubación con CC, PD169316 y apocinina.

En conclusión, alta D-glucosa incrementa la expresión y actividad del complejo de NADPH oxidasa a través de un mecanismo mediado por la actividad de PKC, p38^MAPK y la propia NOX2 en endotelio fetal humano. Además, alta D-glucosa incrementa la expresión del mRNA de MPO, respaldando el uso de apocinina como inhibidor de NOX en HUVEC y, aún más importante, mostrando un potencial rol de MPO en la respuesta celular al estrés inducido por alta D-glucosa.

Abstract

The hyperglycemia is associated with cardiovascular problems in a mechanism that involves endothelial dysfunction, which is caused by a decrease of NO’s bioavailability generated by an increase of reactive oxygen species (ROS) induced by high extracellular concentration of D-glucose. Protein kinase C (PKC) and p38^MAPK could be involved as modulators of the synthesis of superoxide by NADPH oxidase (NOX), the main source of superoxide in human endothelium. Our aim was to determine if the signaling pathway induced by high extracellular D-glucose involves the modulation of expression of NOX and if it is dependent of activity of PKC and/or p38^MAPK.

Biological samples were obtained from normal pregnancies (Guillermo Grant Benavente Hospital ethics committee approval and informed patients consent were obtained). Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated by collagenase digestion (37°C) and cultured medium 199 (M199) supplemented with 20% newborn and fetal calf sera. HUVEC were incubated (24 h) with M199 containing 5 mM (control) or 25 mM of D-glucose (high D-glucose) in absence or presence of calphostin C (CC,PKC inhibitor), PD169316 (p38^MAPK inhibitor) and/or apocynin (NOX inhibitor). mRNA levels were determined by RT-PCR from total RNA using primers for NOX2, NOX4, p47^phox, myeloperoxidase (MPO) and 28S; the abundance of protein p67^phox by western blot andthe ROS levels by fluorescence derivated from oxidation of dichlorofluorescein (DCF).

High D-glucose increased (ANOVA unpaired Student’s test, p<0.05) the mRNA of p47^phox, NOX2 and NOX4. Increases of NOX2 and NOX4 levels were blocked by co-incubation with CC, PD169316 and apocynin. Co-incubation of CC and PD169316 do not show an additive response in presence of high D-glucose. Moreover, MPO was detected in HUVEC,wich is a key protein in the inhibition mechanism of apocynin. As well as the mRNAs, high D-glucose induced an increase of abundance of p67^phox and increased the synthesis of ROS, effects blocked by co –incubation with CC, PD169316 and apocynin.

In conclusion, high D-glucose increases the expression and activity of the NAPH oxidase complex through a mechanism mediated by the activity of PKC, p38^MAPK and NOX2 on human fetal endothelium. Also, high D-glucose increases the MPO expression, validating the use of apocynin like NOX inhibitor in HUVEC and, most importantly, showing a potential role of MPO in cellular responses to stress induced by high D-glucose.

Tesis realizada por Roberto Villalobos para obtener título de Bioquímico, Universidad de Concepción, 2012.

Dr. Marcelo González Participó en Reunión de la Unión Internacional de Ciencias Fisiológicas en Birmingham, Reino Unido

El Laboratorio de Fisiología Vascular del Departamento de Fisiología de la Facultad de Ciencias Biológicas, presentó un trabajo en la Reunión de la Unión Internacional de Ciencias Fisiológicas (IUPS) que tuvo lugar desde el 21 de julio al 26, en  Birmingham, Reino Unido. Este evento internacional se realiza cada cuatro años y reúne a Sociedades de Ciencias Fisiológicas de todo el planeta. 

En esta cita científica, el Laboratorio de Fisiología Vascular estuvo representado por el Profesor Marcelo González Ortiz, quien también llevó la representación como delegado de la Sociedad Chilena de Ciencias Fisiológicas ante la IUPS.

El Dr. González  presentó el trabajo "Effects of acute or long-term incubation with high D-glucose on  mechanisms that induces nitric oxide and reactive oxygen species in human fetal endothelium", de los autores Valenzuela, C., Ávila, P., Rojas, S., Villalobos, R.,Palma, C., Gallardo, V., González, M.

Luego de concluida la reunión en Birmingham, Reino Unido, el Profesor González fue invitado a visitar el Laboratorio del Dr. Gernot Desoye, en la Universidad de Graz, Austria, oportunidad en que ofreció una charla sobre el trabajo que se realiza en el Laboratorio de Fisiología Vascular. Cabe destacar que el Dr. Desoye es uno de los líderes mundiales en el campo de la investigación en diabetes gestacional y señalización de insulina en placenta humana.

http://csbiolmas.blogspot.com/2013/08/dr-marcelo-gonzalez-participo-en.html

LFV en la Reunión Anual de la Soc. Chilena de Ciencias Fisiológicas

Los estudiantes de nuestro laboratorio, Cristina Valenzuela y Roberto Villalobos, presentaran los siguientes trabajos:

EFECTO DE LA INCUBACIÓN AGUDA A ALTA CONCENTRACIÓN DE D-GLUCOSA SOBRE EL TRANSPORTE DE L-ARGININA EN ENDOTELIO FETAL HUMANO. (Effect of accute incubation with high concentration of D-glucose on L-arginine transport in human fetal endothelium). Valenzuela, C., Rojas, S., Villalobos, R., Palma, C., Gallardo, V., González, M. Laboratorio de Fisiología Vascular, Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, Concepción.

ALTA CONCENTRACIÓN DE D-GLUCOSA AUMENTA LA EXPRESIÓN Y ACTIVIDAD DE NADPH OXIDASA MEDIANTE LA ACTIVIDAD DE PKC y p38MAPK EN HUVEC. (High D-glucose increases the expression and activity of NADPH oxidase mediated by PKC and p38MAPK in HUVEC). 1Villalobos, R., 1Rojas, S., 1Palma, C., 1Gallardo, V., 2Aguayo, C., 1González, M. 1Laboratorio de Fisiología Vascular, Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. 2Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción.

Además, el Profesor Marcelo González participará en el Simposio MECHANISMS OF INSULIN BIOLOGICAL ACTION IN DISEASE, con un trabajo titulado "OXIDATIVE STRESS AND PLACENTAL VASCULAR REACTIVITY IN RESPONSE TO INSULIN".

Taller Internacional de Postgrado (IPW 2012)

El Laboratorio de Fisiología vascular presentó 3 trabajos en el último Taller Internacional de Postgrado (IPW), realizado entre el 2 y 3 de Octubre pasado en la P. Universidad Católica de Chile.

Los trabajos presentados fueron los siguientes:

High D-glucose increases the activity and expression of NADPH oxidase involving the activity of PKC and p38^mapk in HUVEC. Villalobos R, Palma C, Careaga P, Cabrera L, Rojas S, Gallardo V, González M.

Regulation by insulin of abundance and activity of hCAT-1 in human endothelium from normal and gestational diabetes pregnancies. ¹Valdivia L, ¹Rojas S, ¹Villalobos R, ¹Palma C, ²Vigueras A, ¹González M.

Oxidative Stress and Insulin.

Marcelo González Ortiz

http://medicina.uc.cl/octubre-2012/taller-internacional-de-postgrado-reune-a-investigadores-chilenos-y-extranjeros-en-torno-a-los-mecanismos-de-las-disfunciones-vasculares

DECLARACIÓN DEL CONSEJO DE SOCIEDADES CIENTÍFICAS DE CHILE

EL CONSEJO DE SOCIEDADES CIENTIFICAS DE CHILE ha emitido recientemente una declaración que da cuenta de la preocupación de las organizaciones que reúnen a los profesionales del país dedicados a la investigación científica por anuncios gubernamentales.

Chile necesita una política de Estado para su desarrollo científico

            En la era del conocimiento, la investigación científica es una actividad estratégica clave de desarrollo pues, además de generar conocimiento universal, provee las herramientas para aprovecharlo, ampliarlo y proyectarlo, tanto en el plano intelectual como en sus aplicaciones, al generar el capital humano avanzado necesario. Todos los campos del conocimiento científico, incluidos los de las humanidades y ciencias sociales, pretenden con sus resultados beneficiar a la sociedad, por lo que para su desarrollo requieren depender administrativamente de la misma autoridad institucional.

            Recientemente, el Ministro Pablo Longueira ha anunciado la intención del actual gobierno de traspasar la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica, CONICYT, desde el Ministerio de Educación al de Economía, argumentando la necesidad de nuestro país de impulsar la innovación como motor del desarrollo económico.

            Como se ha demostrado en los estudios realizados por las Sociedades Científicas, la Academia de Ciencias y el movimiento Más Ciencia para Chile, el problema no es de cuál ministerio deba depender CONICYT, sino el de la ausencia de una política de Estado en materias de investigación científica y    tecnológica que sea independiente de los gobiernos de turno.

            Hoy, una vez más, observamos con temor que se anuncian medidas que involucran nuestro desarrollo científico y tecnológico, sin que detectemos signo alguno de una discusión nacional al respecto.

            El anuncio de cambio de la dependencia de CONICYT ha sido discutido por la comunidad científica y sus inquietudes recogidas por el Consejo de Sociedades Científicas de Chile. A la luz de la experiencia de los países que forman parte de la OCDE, (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos), es importante considerar la instalación de un Ministerio de Ciencia y Tecnología. No obstante, y como se trata de una autoridad sujeta a la ideología del gobierno de turno, parece adecuado considerar – alternativamente – la creación de un Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología; un cuerpo autónomo del Estado de Chile, con rango ministerial, que elabore las políticas de desarrollo de estos ámbitos a largo plazo, dentro del cual esté considerado el fomento de las artes, filosofía, ciencias, letras, etc. en forma armónica y de acuerdo con el desarrollo general del país.

            Este Consejo debiese estar integrado por eminentes representantes de la cultura universal en Chile (y no por designaciones políticas). ¿Su principal tarea? La elaboración y materialización de un Proyecto de desarrollo a largo plazo, de acuerdo con las necesidades del país.

            Adicionalmente, recogiendo la experiencia de los países de la OCDE, para impulsar una política de Estado en materia de ciencia y tecnología, es necesario destinarle un porcentaje del PIB mayor que el actual, que debiera ser ‐por lo menos‐ de un 1,2 % de dicho producto, cifra que aún no se alcanza y que es más que el doble que la actual.

            La actividad empresarial, inquietud principal del actual Gobierno, preocupada de alcanzar resultados muy específicos y en un tiempo corto, no puede destinar recursos para investigaciones de largo alcance que van más allá de los intereses particulares de una empresa. Muchas de esas investigaciones benefician al conjunto de nuestra población o tienen importancia universal. Por ende, es responsabilidad ineludible del Estado proveer la mayor parte de dicho presupuesto. Actualmente nuestro país se encuentra en una situación muy favorable para hacer un importante gesto en esta dirección.

            Llamamos a las autoridades de gobierno a dar los pasos fundamentales para situar a nuestro país en la senda de su desarrollo pleno, generando las condiciones para una verdadera reflexión sobre la institucionalidad que nuestra cultura necesita.

Firman: Consejo de Sociedades Científicas de Chile

Asociación Chilena de Control ‐ Automático Sociedad Agronómica de Chile ‐Sociedad Científica de Psicología de Chile ‐ Sociedad Chilena de Astronomía ‐Sociedad Chilena de Ciencias del Mar - Sociedad Chilena de Ciencias Fisiológicas ‐Sociedad Chilena de Estadística ‐ Sociedad Chilena deFarmacología ‐ Sociedad Chilena de Física ‐ Sociedad Chilena de Inmunología ‐ Sociedad Chilena de Nutrición, Bromatología y Toxicología ‐ Sociedad Chilena de Neurociencia ‐Sociedad Chilena de Química ‐ Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo ‐ Sociedad de Biología de Chile ‐ Sociedad de Biología Celular de Chile ‐ Sociedad de Biología Evolutiva de Chile ‐ Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile ‐Sociedad de Botánica de Chile ‐ Sociedad de Ecología de Chile ‐ Sociedad de Genética de Chile ‐ Sociedad de Matemática de Chile ‐Sociedad de Microbiología de Chile ‐ Sociedad de Química Ambiental de Chile ‐ Sociedad Geológica de Chile

LFV presenta trabajo en Suiza

Laboratorio de Fisiología Vascular de la U. de Concepción presentará un trabajo en la próxima reunión anual de la Sociedad Internacional para el estudio de la Hipertensión en el Embarazo. Esta reunión se realizará en Ginebra, Suiza, el próximo mes de Julio.

El trabajo presentado y los autores del mismo es el siguiente:


REGULATION OF HEME OXYGENASE/CARBON MONOXIDE (HO/CO) AND L-ARGININE/NITRIC OXIDE (NO) PATHWAYS BY HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN (HCG) IN HUMAN FETAL ENDOTHELIUM.
C. Palma, C. Zamora, M. González, V. Gallardo
Fisiología, Universidad de Concepción, Concepción, Chile