Curso Internacional de Postgrado: Estudios de la función vascular humana: desde lo molecular a la clínica

“Estudios de la función vascular humana: desde lo molecular a la clínica”

Descripción: Curso teórico-práctico destinado a brindar conocimientos actualizados y relevantes sobre mecanismos fisiopatológicos relevantes para la salud vascular humana. Se revisarán metodologías como reactividad vascular, perfusión de placenta, cultivo de células endoteliales y progenitoras endoteliales, biología celular y molecular aplicada a la descripción de mecanismos de protección vascular, regulación del tono vascular y angiogénesis.

Expositor(es):

- Prof. Mark Wareing, Universidad de Manchester, Reino Unido

- Prof. Carlos Escudero, Universidad del Biobío, Chile.

- Prof. Claudio Aguayo, Universidad de Concepción, Chile.

- Prof. Marcelo Farías, P. Universidad Católica de Chile, Chile.

- Prof. Luis Sobrevía, P. Universidad Católica de Chile, Chile.

- Prof. Marcelo González, Universidad de Concepción, Chile.

Fecha de inicio: 27 de Enero de 2013

Fecha de término: 29 de Enero de 2013

Lugar de realización: Auditorio Vivaldi

Horario: 09:00 a 13:00 hrs. / 15:00 a 19:00

Código: 4130015

Horas teóricas: 12

Horas prácticas: 8

Créditos: 1

Idioma: Español e inglés

Cupos: 20

Programa tutor: Magíster en Fisiología Humana

Profesor coordinador: Marcelo González

E-mail de contacto (prof. coordinador): mgonzalezo@udec.cl

Teléfono: (56 – 42) 266 1207

Destinado a: Estudiantes de postgrado de las áreas de Ciencias Biológicas, Ciencias de la Salud, Bioquímica y Farmacia

*Estudiantes de pregrado también podrán participar como oyentes.

Visión del Laboratorio de Fisiología Vascular - U. de Concepción

Vascular Physiology Laboratory

Our main interest is focused on elucidating mechanisms regulating vascular tone and deterioration suffered by these mechanisms when tissues are exposed to conditions that produce oxidative stress in normal or pathological conditions.
Our experimental approach seeks to explain pathohysiological phenomena  from molecular and cellular mechanism. Therefore, our students are training in classical techniques of vascular physiology  (wire myography, placenta perfusion), cell culture (human endothelium and smooth muscle cells), biophysics (membrane transport), molecular biology (RT -PCR, qPCR, promoter cloning, transfection), biochemistry (western blot, cell fractionation, etc.).
Actually, our laboratory is in an early stage of development, being one of our objectives the identification of biomarkers for diagnosis and/or treatment of cardiovascular disease associated with the development of obstetric pathologies such as gestational diabetes mellitus or preeclampsia. In addition, the use of tissues and cells of human origin allows us to extrapolate our results to chronic diseases with high incidence in chilean population, such as diabetes mellitus , hypertension and atherosclerosis.

Laboratorio de Fisiología Vascular

Nuestro enfoque experimental busca explicar fenómenos fisiológicos y/o fisiopatológicos desde una base molecular-celular. Por lo tanto nuestros estudiantes se entrenan en técnicas de fisiología vascular clásica (miografía de alambre, perfusión de placenta), cultivo celular (células endoteliales y de músculo liso humanas), biofísica (transporte de membrana), biología molecular (RT-PCR, qPCR, clonamiento de promotores, transfección), bioquímica (western blot, fraccionamiento celular), etc.
Cabe destacar que el trabajo en nuestro laboratorio se encuentra en una primera etapa de desarrollo, siendo unos de nuestros objetivos en el mediano plazo la identificación de biomarcadores para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades cardiovasculares asociadas al desarrollo de patologías obstétricas como diabetes mellitus gestacional o preeclampsia. Además, la utilización de tejidos y células de origen humano nos permite extrapolar nuestros resultados a patologías crónicas de alta incidencia en la población chilena como son la diabetes mellitus, hipertensión y ateroesclerosis.

Nuestro principal interés se enfoca en dilucidar mecanismos de regulación del tono vascular y el deterioro que sufren estos mecanismos cuando los tejidos se ven expuestos a condiciones que producen estrés oxidativo o cuando provienen de patologías que producen esta condición alterada.

Diciembre de 2013

Estudios sobre vasculatura humana de diabetes gestacional presentado en el Congreso de la Sociedad de Farmacología de Chile.

Trabajo presentado en XXXV Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile. 27-30 Noviembre. Valdivia

Reactividad vascular de placenta humana proveniente de embarazos con diabetes mellitus gestacional, en respuesta a U46619 e insulina.
1Valdivia L, 1Rojas S, 2Cid M, 1González M

1Laboratorio de Fisiología Vascular, Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, Chile. P.O. Box 160-C, Concepción, Chile. 2Departamento de Obstetricia y Puericultura, Facultad de Medicina, Universidad de Concepción, Chile. P.O. Box 160-C, Concepción, Chile.

La diabetes mellitus gestacional (DMG) es la intolerancia a los hidratos de carbono de variada gravedad que comienza o se reconoce por primera vez, durante el embarazo (1). En Chile, la frecuencia de diabetes gestacional es del 3-5% de los embarazos, pero este porcentaje llega hasta el 10-14% si consideramos los factores de riesgo de diabetes (2). Hay un consenso de que el GDM es un grave problema para la salud pública, con consecuencias para la madre y los hijos, en relación con las probabilidades de desarrollo de enfermedades metabólicas y cardiovasculares en la edad adulta (3, 4). La diabetes mellitus gestacional se ha asociado con la disfunción vascular fetoplacentaria, condición relacionada con alteraciones en la ruta L-arginina/NO y el tono vascular de los tejidos fetoplacentarios (5). Estas alteraciones inducirían cambios en las respuestas vasculares a diferentes agonistas, como son el U46619 (análogo de tromboxano A2) e insulina. En venas umbilicales y de placa coriónica U46619 aumenta la vasoconstricción, mientras que insulina actúa como un vasodilatador mediante un mecanismo relacionado con la síntesis de NO (6). Los efectos de estos agonistas en microcirculación de placenta de DMG es desconocido.

Nuestro objetivo principal fue determinar la reactividad vascular en microcirculación placentaria de DMG en respuesta a U46619 e insulina.

Conclusiones:

q  De acuerdo a los parámetros obstétricos y perinatales , las principales diferencias se establecen el índice de cesáreas en madres diabéticas, sin registrarse diferencias importantes en el porcentaje de recién nacidos grandes para su edad gestacional.

q  Los datos nutricionales indican que hay un importante porcentaje de madres sin diagnóstico de diabetes pero con sobrepeso u obesidad.. El porcentaje de obesidad entre primer y último control aumenta en mayor medida en madres  diabéticas.

q       La sensibilidad a U46619 no varía entre placentas normales y diabéticas, sin embargo se debe destacar que efecto del análogo de tromboxano es mayor  en DG cuando se utiliza una sola concentración de 10 nM.

q     Según los datos preliminares, podría haber una respuesta diferencial al U46619 de acuerdo al estado nutricional materno, independiente del diagnóstico de DG.

q     El efecto vascular de insulina podría verse alterado en DG, siendo menor el efecto relajante de la hormona en microcirculación de placenta diabética.

(1) Catalano PM, Kirwan JP, Haugel-de Mouzon S, King J. Gestational diabetes and insulin resistance: role in short- and long-term implications for mother and fetus. J Nutr. 2003 ;133: 1674S-1683S.
(2) Guía Clínica, Examen de Medicina Preventiva. Series guías clínicas MINSAL, Ministerio de Salud, Chile. 2008.
(3) Barden A, Singh R, Walters B, Phillips M, Beilin LJ. A simple scoring method using cardiometabolic risk measurements in pregnancy to determine 10-year risk of type 2 diabetes in women with gestational diabetes. Nutr Diabetes. 2013; 3: e72.
(4) Wadsack C, Desoye G, Hiden U. The feto-placental endothelium in pregnancy pathologies. Wien Med Wochenschr, 2012. 162(9-10): 220-224.
(5) Escudero, C., et al., The Role of Placenta in the Fetal Programming Associated to Gestational Diabetes. Gestational Diabetes - Causes, Diagnosis and Treatment. 2013 (Book chapter).
(6) González M, Gallardo V, Rodríguez N, Salomón C, Westermeier F, Guzmán-Gutiérrez E, Abarzúa F, Leiva A, Casanello P, Sobrevia L. Insulin-stimulated L-arginine transport requires SLC7A1 gene expression and is associated with human umbilical vein relaxation. J Cell Physiol. 2011; 226(11): 2916-2924.

Agradecimientos:

FONDECYT 11100192, Hospital Regional Guillermo Grant Benavente, Concepción. 

EFECTO DEL ESTRÉS OXIDATIVO SOBRE LA EXPRESIÓN Y ACTIVIDAD DE TRANSPORTADORES DE L-ARGININA EN ENDOTELIO FETAL HUMANO

RESUMEN

El estrés oxidativo juega un papel clave en la fisiopatología de las enfermedades vasculares tales como hipertensión, aterosclerosis, diabetes mellitus y cardiomiopatías. Esto ocurre cuando aumentan los niveles intracelulares deespecies reactivas derivadas del oxígeno (ROS), disminuyendo la biodisponibilidad del óxido nítrico (NO), un vasodilatador sintetizado a partir de L-arginina. Este aminoácido se incorpora en las células endoteliales a través de transportadores de aminoácidos catiónicos (hCAT-1 y hCAT-2B). Los efectos de ROS sobre la actividad y/o expresión de hCATs aun no han sido caracterizados en detalle. Nuestro objetivo fue determinar el efecto de la incubación crónica con peróxido de hidrógeno (H₂O₂) en la expresión de hCATs y transporte de L-arginina en endotelio humano.

Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se cultivaron hasta pasaje 2 y fueron tratadas (24h) con H₂O₂ (10^-12-10^-3 M). Los niveles de mRNA de hCAT-1, hCAT2B y 28S fueron determinados por RT-PCR. La abundancia de proteínas de hCAT-1 se determinó por western blot. La captación de L-arginina (100µM) y la cinética de transporte de L-arginina (31,25-1000 µM) se determinó usando L-[³H] arginina en mezcla con L-arginina “fría”. 

Los resultados mostraron que el H₂O₂ aumentó (p<0,05) los niveles de mRNA de hCAT-1 y hCAT-2B. Por otra parte, H₂O₂ disminuyó (p<0,05) la abundancia de proteína hCAT-1 y la captación de L-arginina. Al realizar ensayos de transporte de L-arginina utilizando un amplio rango de concentraciones de este aminoácido fue posible determinar que H₂O₂ disminuye la V_max, mientras que la K_m aparente de transporte se mantuvo sin cambios significativos. 

ABSTRACT

            Oxidative stress plays a key role in vascular diseases such as hypertension, atherosclerosis, diabetes mellitus and cardiomyopathy. This occurs when intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) increase, decreasing the bioavailability of nitric oxide (NO), a vasodilator synthesized from L-arginine. This amino acid is incorporated into endothelial cells by cationic amino acid transporters (hCAT-1 and hCAT-2B). The effects of ROS on activity and/or expression of hCATs are not fully understood. Our aim was determine the effects of chronic incubation with hydrogen peroxide (H₂O₂) on hCATs expression and L-arginine transport in human endothelium.

            Endothelial cells from human umbilical vein (HUVEC) were cultured to passage 2 and treated (24 h) with H₂O₂ (10^-12-10^-3 M).The mRNA levels of hCAT-1, hCAT-2B and 28S were determined by RT-PCR.The protein abundance of hCAT-1 was determined by western blot. L-Arginine uptake (100 µM) and kinetic parameters of L-arginine transport (31,25-1000 µM) was determined using L-[³H]arginine mixed with “cold” L-arginine.

            Results showed that H₂O₂increased (p<0.05) the mRNA levels of hCAT-1 and hCAT-2B. In the other hand,H₂O₂ decreased (p<0.05) the abundance of hCAT-1 protein and L-arginine uptake. When testing L-arginine transport using a wide range of concentrations of this amino acid was possible to determine that H₂O₂ decreases V_max, whereas the apparent K_m of L-arginine transport was maintained without significant changes.

Resumen de Tesis para obtener el título de Bioingeniera de Pamela Careaga, Universidad de Concepción, 2012.

Caracterización de la vía de señalización involucrada en los efectos de alta D-glucosa sobre la expresión de subunidades del complejo NADPH oxidasa en endotelio fetal humano

Resumen

La hiperglicemia está asociada a problemas cardiovasculares por un mecanismo que involucra disfunción endotelial, la cual es causada por una disminución de la biodisponibilidad de NO generada por un incremento de las especies reactivas del oxígeno (ROS) inducido por alta concentración extracelular de D-glucosa. Proteína quinasa C (PKC) y p38^MAPK podrían estar involucradas como moduladores de la síntesis de superóxido (O₂^•-) por NADPH oxidasa (NOX), la principal fuente de O₂^•- en endotelio humano. Nuestro objetivo fue determinar si la vía de señalización inducida por alta D-glucosa extracelular involucra la modulación de la expresión de NOX y si esta es dependiente de la actividad de PKC y/o p38^MAPK.

Las células endoteliales fueron aisladas de la vena del cordón umbilical (HUVEC) de placentas obtenidas de embarazos normales (aprobado por el comité ético del Hospital Guillermo Grant Benavente y con consentimiento informado de las pacientes). La células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) fueron aisladas por digestión con colagenasa (a 37°C) y cultivadas en medio 199 (M199) suplementado con 20% de suero de bovino fetal y de recién nacido. HUVEC fueron incubadas (24h) con M199 conteniendo 5mM (control) o 25 mM de D-glucosa (alta D-glucosa) en ausencia o presencia de calfostina C (CC, inhibidor de PKC), PD169316 (inhibidor de p38^MAPK) y/o apocinina (inhibidor de NOX). Los niveles de mRNA fueron determinados por RT-PCR desde RNA total usando los partidores para NOX2, NOX4, p47^phox, mieloperoxidasa (MPO) y 28S; la abundancia de la proteína p67^phoxfue determinada por western blot y los niveles de ROS por fluorescencia derivada de la oxidación de diclorofluoresceína (DCF).

Alta D-glucosa incrementó  el mRNA de p47^phox, NOX2 y NOX4 en HUVEC (ANOVA prueba tstudent no pareada, p<0.05). Los aumentos de los niveles de mRNA fueron bloqueados por la coincubación con CC, PD169316 y apocinina. La coincubación de CC y PD169316 no muestra una respuesta aditiva en presencia de alta D-glucosa. Además, MPO fue detectada en HUVEC, la cual es una proteína clave en el mecanismo de inhibición de apocinina. Así como en el caso de los niveles de mRNA, alta D-glucosa indujo un aumento de la abundancia de p67^phox e incrementó la síntesis de ROS, efectos bloqueados por la coincubación con CC, PD169316 y apocinina.

En conclusión, alta D-glucosa incrementa la expresión y actividad del complejo de NADPH oxidasa a través de un mecanismo mediado por la actividad de PKC, p38^MAPK y la propia NOX2 en endotelio fetal humano. Además, alta D-glucosa incrementa la expresión del mRNA de MPO, respaldando el uso de apocinina como inhibidor de NOX en HUVEC y, aún más importante, mostrando un potencial rol de MPO en la respuesta celular al estrés inducido por alta D-glucosa.

Abstract

The hyperglycemia is associated with cardiovascular problems in a mechanism that involves endothelial dysfunction, which is caused by a decrease of NO’s bioavailability generated by an increase of reactive oxygen species (ROS) induced by high extracellular concentration of D-glucose. Protein kinase C (PKC) and p38^MAPK could be involved as modulators of the synthesis of superoxide by NADPH oxidase (NOX), the main source of superoxide in human endothelium. Our aim was to determine if the signaling pathway induced by high extracellular D-glucose involves the modulation of expression of NOX and if it is dependent of activity of PKC and/or p38^MAPK.

Biological samples were obtained from normal pregnancies (Guillermo Grant Benavente Hospital ethics committee approval and informed patients consent were obtained). Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated by collagenase digestion (37°C) and cultured medium 199 (M199) supplemented with 20% newborn and fetal calf sera. HUVEC were incubated (24 h) with M199 containing 5 mM (control) or 25 mM of D-glucose (high D-glucose) in absence or presence of calphostin C (CC,PKC inhibitor), PD169316 (p38^MAPK inhibitor) and/or apocynin (NOX inhibitor). mRNA levels were determined by RT-PCR from total RNA using primers for NOX2, NOX4, p47^phox, myeloperoxidase (MPO) and 28S; the abundance of protein p67^phox by western blot andthe ROS levels by fluorescence derivated from oxidation of dichlorofluorescein (DCF).

High D-glucose increased (ANOVA unpaired Student’s test, p<0.05) the mRNA of p47^phox, NOX2 and NOX4. Increases of NOX2 and NOX4 levels were blocked by co-incubation with CC, PD169316 and apocynin. Co-incubation of CC and PD169316 do not show an additive response in presence of high D-glucose. Moreover, MPO was detected in HUVEC,wich is a key protein in the inhibition mechanism of apocynin. As well as the mRNAs, high D-glucose induced an increase of abundance of p67^phox and increased the synthesis of ROS, effects blocked by co –incubation with CC, PD169316 and apocynin.

In conclusion, high D-glucose increases the expression and activity of the NAPH oxidase complex through a mechanism mediated by the activity of PKC, p38^MAPK and NOX2 on human fetal endothelium. Also, high D-glucose increases the MPO expression, validating the use of apocynin like NOX inhibitor in HUVEC and, most importantly, showing a potential role of MPO in cellular responses to stress induced by high D-glucose.

Tesis realizada por Roberto Villalobos para obtener título de Bioquímico, Universidad de Concepción, 2012.

Dr. Marcelo González Participó en Reunión de la Unión Internacional de Ciencias Fisiológicas en Birmingham, Reino Unido

El Laboratorio de Fisiología Vascular del Departamento de Fisiología de la Facultad de Ciencias Biológicas, presentó un trabajo en la Reunión de la Unión Internacional de Ciencias Fisiológicas (IUPS) que tuvo lugar desde el 21 de julio al 26, en  Birmingham, Reino Unido. Este evento internacional se realiza cada cuatro años y reúne a Sociedades de Ciencias Fisiológicas de todo el planeta. 

En esta cita científica, el Laboratorio de Fisiología Vascular estuvo representado por el Profesor Marcelo González Ortiz, quien también llevó la representación como delegado de la Sociedad Chilena de Ciencias Fisiológicas ante la IUPS.

El Dr. González  presentó el trabajo "Effects of acute or long-term incubation with high D-glucose on  mechanisms that induces nitric oxide and reactive oxygen species in human fetal endothelium", de los autores Valenzuela, C., Ávila, P., Rojas, S., Villalobos, R.,Palma, C., Gallardo, V., González, M.

Luego de concluida la reunión en Birmingham, Reino Unido, el Profesor González fue invitado a visitar el Laboratorio del Dr. Gernot Desoye, en la Universidad de Graz, Austria, oportunidad en que ofreció una charla sobre el trabajo que se realiza en el Laboratorio de Fisiología Vascular. Cabe destacar que el Dr. Desoye es uno de los líderes mundiales en el campo de la investigación en diabetes gestacional y señalización de insulina en placenta humana.

http://csbiolmas.blogspot.com/2013/08/dr-marcelo-gonzalez-participo-en.html