RESUMEN
El estrés oxidativo juega un papel clave en la
fisiopatología de las enfermedades vasculares tales como hipertensión,
aterosclerosis, diabetes mellitus y cardiomiopatías. Esto ocurre cuando aumentan los niveles intracelulares deespecies reactivas
derivadas del oxígeno (ROS), disminuyendo la
biodisponibilidad del óxido nítrico (NO), un
vasodilatador sintetizado a partir de L-arginina. Este aminoácido se incorpora
en las células endoteliales a través de transportadores de aminoácidos catiónicos (hCAT-1
y hCAT-2B). Los
efectos de ROS sobre la actividad y/o expresión de hCATs aun no han sido
caracterizados en detalle. Nuestro objetivo fue determinar el
efecto de la incubación crónica con peróxido de hidrógeno (H2O2) en
la expresión de hCATs y transporte de L-arginina en endotelio humano.
Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se cultivaron hasta pasaje 2 y fueron
tratadas (24h) con H2O2 (10-12-10-3 M). Los niveles de mRNA de hCAT-1, hCAT2B y 28S fueron determinados por RT-PCR.
La abundancia de proteínas de hCAT-1 se determinó
por western blot. La captación
de L-arginina (100µM) y la cinética de
transporte de L-arginina (31,25-1000 µM) se determinó usando L-[3H] arginina en mezcla con L-arginina “fría”.
Los resultados mostraron que el H2O2 aumentó
(p<0,05) los niveles de mRNA de hCAT-1
y hCAT-2B. Por otra parte, H2O2
disminuyó (p<0,05) la abundancia de
proteína hCAT-1 y la captación de L-arginina. Al realizar ensayos de
transporte de L-arginina utilizando un amplio rango de concentraciones de este
aminoácido fue posible determinar que H2O2 disminuye la Vmax, mientras que la Km aparente de transporte se
mantuvo sin cambios significativos.
ABSTRACT
Oxidative stress plays a key role in vascular diseases
such as hypertension, atherosclerosis, diabetes mellitus and cardiomyopathy.
This occurs when intracellular levels of reactive oxygen species (ROS)
increase, decreasing the bioavailability of nitric oxide (NO), a vasodilator
synthesized from L-arginine. This amino acid is incorporated into endothelial
cells by cationic amino acid transporters (hCAT-1 and hCAT-2B). The effects of
ROS on activity and/or expression of hCATs are not fully understood. Our aim
was determine the effects of chronic incubation with hydrogen peroxide (H2O2)
on hCATs expression and L-arginine transport in human endothelium.
Endothelial cells from human umbilical vein (HUVEC) were
cultured to passage 2 and treated (24 h) with H2O2
(10-12-10-3 M).The mRNA levels of hCAT-1, hCAT-2B and 28S were
determined by RT-PCR.The protein abundance of hCAT-1 was
determined by western blot. L-Arginine uptake (100 µM) and kinetic
parameters of L-arginine transport (31,25-1000 µM) was determined using L-[3H]arginine
mixed with “cold” L-arginine.
Results showed that H2O2increased (p<0.05) the mRNA
levels of hCAT-1 and hCAT-2B. In the other hand,H2O2 decreased (p<0.05) the
abundance of hCAT-1 protein and L-arginine uptake. When testing L-arginine transport using a wide range
of concentrations of this amino acid was possible to determine that H2O2 decreases Vmax,
whereas the apparent Km of
L-arginine transport was maintained without significant changes.
Resumen de Tesis para obtener el título de Bioingeniera de Pamela Careaga, Universidad de Concepción, 2012.
